W 1932 roku Fleming napisał drugi artykuł, tym razem do „The Journal of Pathology and Bakteriology“, w którym w następujących słowach podkreślił, że nadal kontynuuje swe badania i czyni wysiłki celem zastosowania penicyliny w lecznictwie: „Użyta została w wypadku opieszale gojących się ran i okazała się znacznie skuteczniejsza od wszelkich opatrunków zawierających lekarstwa chemiczne“.
W tym czasie prof. Harold Raistrick, kierownik wydziału biochemii w Londyńskiej Szkole Higieny i Medycyny Tropikalnej, zainteresował się pomysłem Fleminga. Raistric pod wpływem Gowland Hopkinsa, z którym poprzednio kolegował w Cambridge, zajął się pleśniami i grzybniami. W roku 1931 postanowił zbadać pleśń Fleminga i w tym celu zaprosił do współpracy dra Lovella, bakteriologa z tej szkoły. Hodowle pleśni otrzymał zarówno od Fleminga jak i Lister Institute. Raistrick orientował się od początku, że jedną z przeszkód w wyprodukowaniu penicyliny była trudność otrzymania pożywki, którą posługiwał się Fleming, pożywki składającej się głównie z mięśni serca, gruczołów i innych organów. Pierwszą więc jego próbą i pierwszym triumfem było przygotowanie pożywki o składzie chemicznym, na której bakterie mogły się rozwijać. Dorzucił i inne, mniejsze ogniwa do łańcucha poszukiwań. Lecz jego następnym ważnym odkryciem było stwierdzenie wbrew zdaniu Fleminga, że penicylina mogła być uzyskiwana także przy pomocy eteru. Raistrick odkrył również, że złożona w lodzie i utrzymywana w niskiej temperaturze, nie traci ona przez trzy miesiące nic ze swej wartości.
Niestety, dr Lowell w tym okresie opuścił Szkołę Higieny, bez bakteriologa zaś sam chemik nie mógł kontynuować doświadczeń. Tym sposobem Fleming-bakteriolog nie doszedł do wyników z powodu braku chemika wśród pracowników, a Raistrick, chemik, zmuszony był do przerwania pracy, gdyż nie miał bakteriologa. Dlaczego ci dwaj nie przeprowadzili badań razem, trudno powiedzieć.
W tym okresie dr Paine, który poprzednio studiował u Fleminga w szpitalu St. Mary, po przeczytaniu jego artykułu w „The Journal of Experimental Pathology“ zwrócił się z prośbą o przesłanie mu kultury pleśni do Sheffield. Rozpoczął doświadczenia na swych pacjentach, lecząc trzy przypadki przewlekłego zakażenia skóry przy pomocy opatrunków, maczanych w przefiltrowanej pożywce. Stosował je co cztery godziny, lecz pod koniec tygodnia stan pacjentów me wykazał żadnego polepszenia. „Rezultatów — powiedział Paine — nie było żadnych i gdy teraz zastanawiam się, widzę, że stosując bardzo niską zawartość penicyliny, nie było w tym nic dziwnego.“ Wtenczas wydało mu się to jednak zastanawiające: doświadczenie Fleminga wskazywało, że gronkowce były bardzo wrażliwe na penicylinę, podczas gdy kliniczne zastosowanie jej stało w sprzeczności z odkryciami laboratoryjnymi.
Tymczasem w toku doświadczeń penicylinę wypróbowano również na czterech niemowlętach w tym samym szpitalu. Oczy dwojga z nich były zakażone gronkowcami, podczas gdy dwoje pozostałych matka zaraziła przy urodzeniu rzeżączką. W przeciągu trzech dni dwoje chorych na rzeżączkę wyleczono, podobnie jak trzecie dziecko, chore na oczy. Czwarte nie zareagowało na leczenie.
Jeszcze jeden z eksperymentów w Sheffield zasługuje na uwagę. Kierownik pewnej kopalni zraniony był małym odpryskiem kamienia, który przebił mu prawe oko i ulokował się pod źrenicą. Okazało się. że oko jest w stanie zapalnym, co bardzo zwiększało niebezpieczeństwo koniecznej operacji. Przez 48 godzin oko skraplano przefiltrowaną penicyliną, która jak dowodził Fleming, winna była usunąć zakażenie. Po pewnym czasie silne napięcie w gałce ocznej ustąpiło, zarazki zostały zlikwidowane, dokonano operacji i pacjent, który miał szczęście, że penicylinę zastosowano w jego przypadku, odzyskał normalny wzrok w zranionym oku.
Lecz nawet i wtedy penicyliny nie doprowadzono do tego stopnia rozwoju, w którym poznamy ją później, pod koniec wojny. Dr Paine tłumaczy przerwanie swych eksperymentów i prób następująco: „Zmienność mocy penicyliny oraz rozpoczęcie innych prac zmusiły mnie do porzuceń; a dalszych prób… Jak można się domyślić, często tego później żałowałem.“
Tymczasem w laboratoriach Szpitala St. Mary w Lister Institute pleśń penicyliny trwała nadal nie zmieniona w swych probówkach. Wydawało się już, że natura zbyt przemyślnie ukryła swój sekret. Pacjenci, którzy mogli być tak łatwo uleczeni penicyliną, umierali nadal w szpitalach, dopóki patolog, obznajmiony z zagadnieniami biologii, oraz chemik, zdolny do przeprowadzenia doświadczeń chemicznych, nie spotkali się z sobą. Byli to: patolog w Sir William Dunn School of Bathology w Oxfordzie i dyrektor działu chemii w tej samej szkole, prof. Howard Florey, oraz dr E. B. Chain.
Howard Florey jest Australijczykiem, urodzony w Adelajdzie w roku 1898. Tam też otrzymał dyplom lekarza. Dalsze tytuły: magistra nauk humanistycznych, magistra nauk ścisłych oraz doktora filozofii zdobył w krótkim czasie po roku 1922, w którym po raz pierwszy wylądował w Anglii. Dr Chain jest Żydem pochodzenia rosyjskiego. który kształcił się w Niemczech, a w roku 1933 jako uchodźca z hitlerowskich Niemiec, przybył co Anglii, przywożąc ze sobą duży zasób wiedzy chemicznej i zamiłowanie do muzyki klasycznej, szczególnie Brahmsa. Jego miłość do muzyki jest poparta wybitnym talentem w tym kierunku i w początkach swego pobytu w Anglii Chain nie mógł się zdecydować, czy obrać karierę chemika, czy też pianisty. Dał szereg koncertów w Camridge i Oxfordzie. Chain ma opinię człowieka nerwowego, energicznego i o dużym temperamencie, nie znoszącego głupców — z wyglądu przypomina chwilami Einsteina, chwilami znów Stalina.